植物激素的檢測方法

植物激素的檢測方法     

摘要：植物激素是植物體內(nèi)的微量信號(hào)分子，它們幾乎調(diào)節(jié)著植物生長發(fā)育的所有過程，植物，植物激素的檢測常用方法有   

關(guān)鍵詞：植物激素的檢測；生物試法；色譜檢測法；免疫檢測法   

1 植物激素的介紹  植物激素是指植物細(xì)胞接受特定環(huán)境信號(hào)誘導(dǎo)產(chǎn)生的、低濃度時(shí)可調(diào)節(jié)植物生理反應(yīng)的活性物質(zhì)。  植物激素有六大類：即生長素（auxin）、赤霉素（GA）、細(xì)胞分裂素（CTK）、脫落酸（abscisic acid，ABA）、乙烯（ethyne，ETH）和油菜素甾醇（brassinosteroid，BR）。它們都是些簡單的小分子有機(jī)化合物，但它們的生理效應(yīng)卻非常復(fù)雜、多樣。  

2 植物激素檢測方法研究

 2.1 生物試法   

生物試法是zui早檢測植物激素的方法，它是依據(jù)植物激素的生理活性，通過某些植物的組織或器官產(chǎn)生的特異性反應(yīng)來進(jìn)行檢測。  1928年F W Went首先建立了檢測植物生長素的燕麥芽鞘彎曲測試法,但方法復(fù)雜,若沒有熟練的技巧,就很難取得準(zhǔn)確的結(jié)果。因此在1933年, Thimann K V和J Bonner把這個(gè)方法改變了一下建立了燕麥葉鞘切斷伸長法,簡化了操作方法。此后,隨著ABA、CTK、GA等激素的逐一發(fā)現(xiàn),相應(yīng)的各類激素的測定方法也被廣泛建立。例如,小麥胚芽鞘切斷抑制法檢測ABA;煙草髓愈傷組織鑒定法和胡蘿卜根愈傷組織鑒定法鑒定CTK;矮生豌豆法、大麥胚芽鑒定法和點(diǎn)滴法鑒定GAs等等[1]。生物試法具有簡便易行的特點(diǎn)，能夠反應(yīng)植物激素的生理活性，還可以鑒定新的植物激素和生理活性物質(zhì)，因此至今仍然得到廣泛的應(yīng)用。但其不足之處在于，植物體內(nèi)往往存在許多激素分子的類似物、代謝物、拮抗物或其他干擾物質(zhì)，從而影響生物試法的檢測結(jié)果[2]。此外還要盡量控制環(huán)境因子和使用的植物材料的均一性，以便檢測結(jié)果的準(zhǔn)確、可靠。  20世紀(jì)90年代Wout Boerjan[3]等建立的重組DNA技術(shù)定量檢測生長素和細(xì)胞分裂素的方法可謂是這一領(lǐng)域的一個(gè)重要進(jìn)展。這一方法主要利用生長素和細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)構(gòu)建Pg5-GUS基因表達(dá),通過測量表達(dá)產(chǎn)物定量檢測IAA和CTK建立起來的,其檢測靈敏度為IAA達(dá)5×10-8mol,反ZT達(dá)5×10-11mol。此法不象經(jīng)典的生物試法那樣,只對(duì)一種激素專一,它能同時(shí)檢測生長素和細(xì)胞分裂素的活性;此法從分子水平著手,以莖段、胚芽鞘和愈傷組織作為分析材料,細(xì)胞更具同源性和一致性。 

 2.2 生物鑒定法  生物測試法是zui早采用的植物激素測定方法，它是利用植物激素的生理活性，通過某些植物的組織和器官對(duì)植物激素，產(chǎn)生的特異性反應(yīng)進(jìn)行測定的。但

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 2.3 色譜檢測法 

2.3.1 氣相色譜法 GC可以用于所有植物激素的分析，但首先要經(jīng)過甲基化和*基硅烷化才可以進(jìn)行分析。乙烯作為氣態(tài)激素主要用GC測定。GC 的檢測器可分為質(zhì)量型和濃度型2種，前者包括火焰離子化檢測器（FID）和火焰光度檢測器（FPD）等；后者包括熱導(dǎo)檢測器（TCD）和電子捕獲檢測器（ECD），分析植物激素多用氫焰離子化器。目前，GC與質(zhì)譜聯(lián)用的方法在植物激素的檢測中已有廣泛的應(yīng)用，而且還可鑒定未知物質(zhì)的結(jié)構(gòu)，這對(duì)于研究新的植物激素具有重要意義，但需經(jīng)冗長的樣品純化程序，設(shè)備昂貴，使用和維護(hù)成本高。 

2.3.2 液相色譜法 目前，HPLC已在除乙烯外的四大類植物激素分析領(lǐng)域中不斷地發(fā)展應(yīng)用。色譜柱可分為液-液分配柱、液-固吸附柱、離子交換柱等。檢測器也可以有多種選擇，常用是紫外檢測器。HPLC配合紫外檢測器已成為植物內(nèi)源激素分析的有效手段，它可聯(lián)合測定植物組織抽提液中的多種內(nèi)源激素。近年來對(duì)液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用的應(yīng)用越來越多，利用質(zhì)譜作為檢測器，彌補(bǔ)了靈敏度的弱點(diǎn)。液質(zhì)聯(lián)用是目前植物激素分析的發(fā)展趨勢。有研究應(yīng)用反相液相色譜與串聯(lián)電噴霧離子質(zhì)譜法對(duì)ABA進(jìn)行檢測，度能達(dá)到0.89ng/g，并在0 ～ 1.5ng 間保持線性[4] 。 

 2.4 免疫檢測法  放射免疫分析（RIA）和酶聯(lián)免疫法（ELISA）是植物激素免疫測定測試中zui常用的，但是放射性物質(zhì)會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)人員有危害。近年來，隨著各項(xiàng)分析技術(shù)的發(fā)展，有報(bào)道運(yùn)用免疫層析技術(shù)和液相電噴霧質(zhì)譜法結(jié)合的方法檢測植物激素，在專一 性和靈敏度方面效果都很好[5]。另有研究植物激素免疫傳感器測定方法[6] ，利用抗原或抗體作為識(shí)別元件，通過抗體培育形成抗體-待測物結(jié)合體，由轉(zhuǎn)換器將生物，化學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)換成電信號(hào)，通過適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM(jìn)行直接或間接地定量檢測。這種方法由于利用了抗體抗原建的高親和性，因此具有很高的靈敏度和選擇性。 免疫學(xué)方法與生物測試法相比不僅提高了檢測靈敏度,可檢測出10-12g的微量物質(zhì),相應(yīng)其前處理也得到了簡化,又改善了測定的專一性,但抗體的制備較復(fù)雜,尤其分子量小的植物激素本身為半抗原,須與牛血清蛋白等偶聯(lián)后才能作抗原,且激素的同系物、前體、類似物以及其他性質(zhì)不明的化合物等存在不可避免地會(huì)出現(xiàn)交叉反應(yīng)。現(xiàn)有人采用單克隆抗體技術(shù)(mAb)[7]生產(chǎn)免疫測定中所需的抗體,解決了免疫測定中所使用抗體的多克隆性,提高了抗體的專一性。酶聯(lián)免疫技術(shù)也常和物理化學(xué)方法聯(lián)用[8]。到目前為止,除乙烯外,其余四大類激素的RIA和ELISA檢測方法均已建立,并有成套的藥盒出售。

小結(jié)：  在上訴的幾種測定方法，電化學(xué)方法也不斷地被應(yīng)用于植物激素的測定中。如Lee等[9]報(bào)道了采用α,β,γ環(huán)糊精(CD)為添加劑的毛細(xì)管區(qū)帶電泳對(duì)吲哚乙酸、2, 4, 5三氯酚乙酸等多種植物激素的分離,具有、快速、樣品預(yù)處理簡單、進(jìn)樣量少的特點(diǎn)。zui近,湖南植物激素重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室與湖南大學(xué)聯(lián)合研制的吲哚乙酸免疫傳感器是繼色譜、質(zhì)譜及其聯(lián)用、酶聯(lián)免疫及放射免疫之后,在植物激素測定方法領(lǐng)域的重大創(chuàng)新與突破[10]。此法不僅靈敏度高,而且有實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)化、連續(xù)化和自動(dòng)化測試的潛力,可能發(fā)展為一種測定植物激素的新型技術(shù)平臺(tái)。  總體而言，近幾年來隨著檢測儀器的不斷推陳出新，各類植物激素的分析檢測方法己得到了很快的發(fā)展，一定程度上也促進(jìn)了植物激素作用機(jī)理的研究。