收到細(xì)胞后如何正確地處理細(xì)胞

                    收到細(xì)胞后如何正確地處理細(xì)胞

以下由@慧穎細(xì)胞庫從事細(xì)胞培養(yǎng)工作的人員總結(jié)給出的建議：
   有經(jīng)驗和剛剛從事細(xì)胞培養(yǎng)工作的人員都應(yīng)該認(rèn)真仔細(xì)地詢問下細(xì)胞提供方提供的建議，提前了解所要培養(yǎng)細(xì)胞的詳細(xì)資料，準(zhǔn)備好細(xì)胞所要用到的培養(yǎng)基和相關(guān)試劑，雖然所有的貼壁，半貼壁或者懸浮細(xì)胞處理方式差不多，但是不同的實驗室培養(yǎng)條件和處理力度還有試劑的批間差這些問題存在，也會導(dǎo)致對細(xì)胞處理不當(dāng)，或者環(huán)境的不適應(yīng)而造成細(xì)胞的死亡。
1.收到細(xì)胞，*時間要鏡檢：觀察細(xì)胞形態(tài)是否正常，對于貼壁細(xì)胞則要注意看貼壁情況是否很好 ，觀察細(xì)胞密度，有疑議及時咨提供細(xì)胞的技術(shù)人員。 由于運輸?shù)臅r間或者溫度的變化，很多貼壁細(xì)胞在盛滿培養(yǎng)基的瓶子里生長的狀態(tài)和平時會有點不一樣，主要是貼壁牢固問題。比如293T，平時貼壁就不是很牢，在裝滿的培養(yǎng)基瓶子里面，會發(fā)生大片的脫落，細(xì)胞聚集在一起，但是細(xì)胞生長還是正常的，通過離心收集，加以胰酶的消化，重新打散，又可以正常的貼壁生長。細(xì)胞接種或傳代以后，實驗者每天或至多間隔1～2d，要對細(xì)胞做常規(guī)性檢查。觀察細(xì)胞形態(tài)和生長情況以及培養(yǎng)的pH變化、有無污染等。根據(jù)細(xì)胞動態(tài)變化，做換液或傳代處理，如發(fā)現(xiàn)異常情況應(yīng)及時采取措施。
2.當(dāng)通過上一步的觀察，細(xì)胞初步?jīng)]有任何問題時，進(jìn)行下一步操作。當(dāng)收到的細(xì)胞密達(dá)到80%左右時，則處理如下：棄除瓶中大部分培養(yǎng)基，僅保留5到10mL培養(yǎng)所需的常規(guī)培養(yǎng)基；或更換新鮮的培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中，隨后每天觀察。 細(xì)胞在低于正常生長溫度情況下，會調(diào)整為靜止期，或者慢速生長期，必須恢復(fù)37度的環(huán)境至少3個小時左右，才能重新調(diào)整到接近對數(shù)生長期的狀態(tài)，在對數(shù)生長期進(jìn)行細(xì)胞的傳代會大大增加傳代的成功率，和細(xì)胞的存活率。生長狀態(tài)良好的細(xì)胞，在一般顯微鏡下觀察時可見，細(xì)胞透明度大、折光性強、輪廓不清。細(xì)胞生長不良時，輪廓增強，胞質(zhì)中常出現(xiàn)空泡、脂滴和其他顆粒狀物，細(xì)胞之間空隙加大，細(xì)胞形態(tài)可變得不規(guī)則甚至失去原有特點，如上皮細(xì)胞變成類上皮細(xì)胞等某些染料當(dāng)細(xì)胞死亡時能透過變性的胞膜與解體的細(xì)胞核DNA結(jié)合，而令其著色。因而常用臺盼藍(lán)（trypan blue） 鑒別細(xì)胞死活，活細(xì)胞不著色，死細(xì)胞核呈藍(lán)色。
3.如果經(jīng)*步觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞密度超過90%，并且細(xì)胞狀態(tài)很好時，則復(fù)溫后2個小時需要立即傳代。傳代的比例應(yīng)依據(jù)不同的細(xì)胞而定。對于生長比較快，狀態(tài)穩(wěn)定，不易受外界影響的細(xì)胞可以一次多傳幾瓶；對于生長較慢，細(xì)胞比較薄，狀態(tài)容易波動的細(xì)胞類型，一次少傳些，保證每瓶細(xì)胞密度大些，便于穩(wěn)定生長。至于一些比較陌生的細(xì)胞，*次處理也可以依照第二種情況。
細(xì)胞傳代操作：

操作間隔應(yīng)讓無菌操作臺運轉(zhuǎn)10分鐘以上后，再進(jìn)行下一個細(xì)胞株之操作；無菌操作工作區(qū)域應(yīng)保持清潔及寬敞，必要物品，例如試管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暫時放置，其它實驗用品用完即應(yīng)移出，以利于氣流之流通。實驗用品以70%ethanol擦拭后才帶入無菌操作臺內(nèi)。實驗操作應(yīng)在抬面之中央無菌區(qū)域，勿在邊緣之非無菌區(qū)域操作。
1.吸除培養(yǎng)瓶內(nèi)舊培養(yǎng)液。
2.加入無菌pbs洗液（5-8mL）輕輕潤濕細(xì)胞，稀釋多余的培養(yǎng)基，之后吸走洗液，動作要輕，不可吹打到細(xì)胞。
3.向瓶內(nèi)加入含0.25%EDTA的胰蛋白酶混合液少許，以能覆滿瓶底為限。
4.置溫箱中2~5分鐘，一旦鏡檢發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)回縮，細(xì)胞間隙增大后，細(xì)胞變圓，比較松動后，立即終止消化。
5.加入該細(xì)胞對應(yīng)的培養(yǎng)基6mL（T25培養(yǎng)瓶）或12mL（T75培養(yǎng)瓶）終止消化。
6.用吸管通過吸取的培養(yǎng)基輕輕反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞，使之從瓶壁脫離形成細(xì)胞懸液。吹打時應(yīng)盡量以zui少的次數(shù)將細(xì)胞從壁上吹下，不僅要控制吹打的力度、次數(shù)，還要注意要將細(xì)胞盡可能吹成單個。這樣既能減少死細(xì)胞，又能便于細(xì)胞再次均勻貼壁生長。
7.依據(jù)傳代比例，將細(xì)胞懸液分瓶，再補充培養(yǎng)基后，靜置于溫箱培養(yǎng)，直止貼壁。
 貼壁細(xì)胞在培養(yǎng)瓶長成致密單層后，繼續(xù)生長的空間不足，培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成份也消耗較多，同時代謝廢物也有較多堆積，需要分瓶培養(yǎng)，對細(xì)胞進(jìn)行傳代擴增。對于貼壁不太緊的細(xì)胞如293，可以直接吹散后分瓶。而對于貼壁較緊的細(xì)胞如CHO，則需要以胰酶消化后再吹散分瓶。以筆者的經(jīng)驗，以輕吹或加培養(yǎng)液后輕搖可下較好，但對于經(jīng)驗不太充分的實驗者而言是較難判斷掌握的。
   胰酶消化的程度是一個關(guān)鍵：消化過度則對細(xì)胞的活性影響較大，并有部分細(xì)胞漂浮，隨棄去的胰酶流失;消化不足則細(xì)胞難于從瓶壁上吹下，反復(fù)吹打同樣也會損傷細(xì)胞活性。影響消化速度的因素較多，主要有胰酶溶液的活性(配制條件、凍存或4℃保存時間長短、是否反復(fù)凍融、解凍后存放時間及溫度等)、消化時的溫度(氣溫、細(xì)胞培養(yǎng)瓶及胰酶溶液的溫度)以及所加胰酶溶液的多少等。含有EDTA的胰酶會比不含的消化能力強很多，不同細(xì)胞對消化液的敏感性也不同，比如HEP-G2人肝癌細(xì)胞，該細(xì)胞消化時間可長達(dá)10分鐘左右。 消化時間仔細(xì)去摸索一下，每過2分鐘鏡下觀察細(xì)胞是否變圓，記錄的時間，下一次操作參考之前的記錄來控制時間即可。對于懸浮細(xì)胞換液時只需要補液就行。
   懸浮細(xì)胞的傳代則不需要用胰酶消化，直接通過計數(shù)算好傳代的比例，直接分瓶，補液。有些懸浮細(xì)胞趨于成團生長，此時細(xì)胞生長狀態(tài)良好，當(dāng)補液時，避免吹打。典型實例：jurkat就是成團生長。當(dāng)jurkat細(xì)胞密度比較大時，可將培養(yǎng)瓶豎直放置2分鐘左右，待大部分細(xì)胞沉下，吸走上層清液，補充等量的新鮮培養(yǎng)基。而 HL-60 就不一樣了，為懸浮單個生長，如果發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞包團，說明細(xì)胞狀態(tài)不好，不加以正確的處理，zui終會發(fā)生凋亡。 

希望我們的建議能給您帶來幫助！