人乳腺導管癌細胞BT-474【BT-474】細胞株

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細胞來源：人乳腺導管癌細胞

細胞簡介：BT-474細胞為人乳腺導管癌細胞，來源于人乳腺導管癌，中文名為人乳腺導管癌細胞，正常的細胞形態(tài)為上皮樣，貼壁生長。

培養(yǎng)基：RPMI-1640 90%, Fetal Bovine Serum 10%

培養(yǎng)條件：37℃ 5% CO2

消化條件：0.25% (w/v) Trypsin-0.53 mM EDTA溶液，消化5-10min

傳化比例：1：2-1：3

換液時間：3-4天換液一次

凍存液比例：85%培養(yǎng)基，10%FBS, 5% (v/v) DMSO

凍存密度：1-3 ×10^6/管，液氮保存

庫存狀態(tài)：現(xiàn)貨

細胞純度：94％

細胞活力：90％（ViabilitybyTrypanBlueExclusion）

細胞檢測：細胞不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細菌、酵母和真菌

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注意事項：

高壓消毒實驗用品：操作臺上不是一次性的物品均需做滅菌處理，無法高壓的物品應使用75%酒精消毒。

消毒操作間和操作臺：使用75%酒精擦拭無菌間的墻面、地面，操作臺的臺面，孵箱，離心機等。操作前須用紫外線照射無菌間和操作臺30分鐘消毒。入無菌間須穿隔離服，戴手套、口罩、帽子。用75%酒精洗去手套上的滑石粉。

無菌操作：操作時應盡量接近酒精燈；拿取吸管時，避免接觸其使用端；不要在開口器皿的上方操作；吸取不同液體應更換吸管。不能碰瓶口。萬一碰到，更換吸管。

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的培養(yǎng)

【初代培養(yǎng)原理】

將動物機體的各種組織從機體中取出，經各種酶（常用胰蛋白酶）、螯合劑（常用EDTA）或機械方法處理，分散成單細胞，置合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細胞得以生存、生長和繁殖，這一過程稱原代培養(yǎng)。

儀器：培養(yǎng)箱（調整至37℃），培養(yǎng)瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、紗布、手術器械、血球計數(shù)板、離心機、水浴箱（37℃）

材料：動物組織塊

試劑：1640培養(yǎng)基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank′s液，碘酒

【初代消化培養(yǎng)法】

（1）準備：取各種已消毒的培養(yǎng)用品置于凈化臺面，紫外線消毒20分鐘。開始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。

（2）布局：點燃酒精燈，安裝吸管帽。

（3）處理組織：把組織塊置于燒杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如懷疑組織可能污染，可先置于含有青鏈霉素的混合液中30~60分鐘。

（4）剪切：用眼科剪把組織切成2~3毫米大小的塊，以便于消化。加入比組織塊總量多30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角燒瓶中，結扎瓶口或塞以膠塞。

（5）消化：或用恒溫水浴，或置于37℃溫箱消化均可，消化中每隔20分鐘應搖動一次，如用電磁恒溫攪拌器消化更好。消化時間依組織塊的大小和組織的硬度而定。

（6）分離：在消化過程中見消化液發(fā)混濁時，可用吸管吸出少許消化液在鏡下觀察，如組織已分散成細胞團或單個細胞，立即終止消化，隨即通過適宜不銹鋼篩，濾掉尚未充分消化開的組織塊。低速（500~1000轉/分）離心消化液5分鐘，吸出上清，加入適量含有血清的培養(yǎng)液。

（7）計數(shù)：用計數(shù)板計數(shù)，如細胞懸液細胞密度過大，再補加培養(yǎng)液調整后，分裝入培養(yǎng)瓶中。對大多數(shù)細胞來說，pH要求在7.2~7.4范圍，培養(yǎng)液呈微紅色，如顏色偏黃，說明液體變酸，可用NaHCO23調整。

（8）培養(yǎng)：置于36.5℃溫箱培養(yǎng)，如用CO2溫箱培養(yǎng)，瓶口需用紗布棉塞或螺旋帽堵塞，紗布塞易生霉菌，每次換液時需要換新塞。

【初代組織塊培養(yǎng)法】

《1》剪切：把組織小塊置于小燒杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污，吸靜Hanks液，用眼科剪反復剪切1mm3塊為止。

《2》擺布：用彎頭吸管吸取若干小塊，置于培養(yǎng)瓶中，用吸管彎頭把組織小塊擺布在培養(yǎng)瓶底部，小塊相互距離以0.5cm為宜，每一25ml培養(yǎng)瓶底可擺布20~30塊。

《3》輕輕翻轉培養(yǎng)瓶，另瓶底向上，注意翻瓶時勿另組織小塊流動，塞好瓶塞，置36.5℃溫箱培養(yǎng)2小時左右（勿超過4小時），使小塊微干涸。

《培養(yǎng)》從微箱中取出培養(yǎng)瓶，開塞，46度斜持培養(yǎng)瓶，箱瓶底腳部輕輕注入培養(yǎng)液少許，然后緩緩再把培養(yǎng)瓶翻轉過來，讓培養(yǎng)液慢慢覆蓋附于瓶地上的組織小塊。置溫箱中靜止培養(yǎng)。待細胞從組織塊游出數(shù)量增多后。再補加培養(yǎng)液。

【傳代培養(yǎng)法原理】

細胞在培養(yǎng)瓶長成致密單層后，已基本上飽和，為使細胞能繼續(xù)生長，同時也將細胞數(shù)量擴大，就必須進行傳代（再培養(yǎng)）。 傳代培養(yǎng)也是一種將細胞種保存下去的方法。同時也是利用培養(yǎng)細胞進行各種實驗的必經過程。懸浮型細胞直接分瓶就可以，而貼壁細胞需經消化后才能分瓶。

【材料和試劑】

1）細胞：貼壁細胞株

2）試劑：0.25％胰酶、DMEM 90%,德國SERANA胎牛血清 Fetal Bovine Serum 10%

3）儀器和器材：倒置顯微鏡，培養(yǎng)箱、培養(yǎng)瓶、吸管、廢液缸等

【操作步驟】

1）吸除培養(yǎng)瓶內舊培養(yǎng)液。

2）向瓶內加入胰蛋白酶和EDTA混合液少許，以能覆滿瓶底為限。

3）置溫箱中2~5分鐘，當發(fā)現(xiàn)細胞質回縮，細胞間隙增大后，立即終止消化。

4）吸除消化液，向瓶內注入Hanks液數(shù)毫升，輕輕轉動培養(yǎng)瓶，把殘余消化液沖掉。注意加Hanks液沖洗細胞時，動作要輕，以免把已松動的細胞沖掉流失，如用胰蛋白酶液單獨消化，吸除胰蛋白酶液后，可不用Hanks液沖洗，直接加入培養(yǎng)液。

5）用吸管吸取營養(yǎng)液輕輕反復吹打瓶壁細胞，使之從瓶壁脫離形成細胞懸液。

6）計數(shù)板計數(shù)后，把細胞懸液分成等份分裝入數(shù)個培養(yǎng)瓶中，置溫箱中培養(yǎng)。

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注意：換液時一半用我們的培養(yǎng)基，一半用你們的，以免細胞不適應而造成生長不好。